По легенде церковь была построена на том самом месте, где в XIV веке были убиты три дружинника Великого князя Литовского Ольгерда: Антоний, Иоанн и Евстафий. Они были повешены в дубовой роще, где казнили преступников за то, что те приняли христианство и открыто проповедовали его среди языческого населения Литвы. Через несколько лет православные христиане стали собираться здесь на молитвы. Вскоре количество паломников значительно возросло и тогда было решено построить небольшую часовню, позже возвели деревянную церковь во имя Святой Троицы.
К началу XVI века церковь Святой Троицы пришла в упадок, обветшала и превратилась в развалины. В 1516-ом году Великий князь Литовский Сигизмунд I разрешил гетману Константину Острожскому снести остатки былой деревянной церквушки и построить новую каменную православную в знак благодарности за победу в Оршанской битве 1514 года. Константин Острожский церковью не ограничился и возвел рядом с ней одноименный монастырь.
В 1608-ом году церковь Святой Троицы была передана униатам. Они, в период с 1622-1624 год, к боковым фасадам пристроили еще две каплицы и ризницу. Кроме того, справа от входа, на средства виленского воеводы Я.С. Тышкевича, дополнительно возвели каплицу, которую осветили в честь Покрова Пресвятой Богородицы.
В 1706-ом году церковь сильно пострадала от пожара, особенно построенная слева от входа каплица Вознесения Святого Креста, которая была приспособлена под женский униатский монастырь. Спустя 42 года в 1748-ом году церковь Святой Троицы снова горела и после, в 1761-ом году, по проекту виленского архитектора Яна Кристофера Глаубица была отреставрирована в барочном стиле. А в 1792-ом году обновили боковые фасады, вместо западной стены сделали пристройку, которая существенно увеличила длину церкви.
Следующие ремонтные работы в церкви Святой Троицы проводились уже под управлением православного духовенства, которой она была передана в 1839-ом году. В период с 1851 по 1852-ой год за ремонт отвечал архитектор М. Прозаров. В 1869 году по проекту архитектора М. Чагина перестроили фасада. В 1878-ом году на завершении западной стены водрузили две башенки.
В наше время храм представляет ансамбль зданий, включающий в себя фрагменты готики, барокко, классицизма. Изначально здание церкви Святой Троицы в плане имело почти квадратную форму, по углам которой располагались башни. Стены усилили контрфорсами, а аспиды и восточные башни украсили арочным поясом. Для строительства церкви использовался кирпич темно-красного и желтого цвета, укладывали его по готической технике. Рядом с церковью, на северо-западе, стоит звонница, вход в которую расположен на значительной высоте, что, разумеется, свидетельствует об оборонительном предназначении этой постройки.
На сегодняшний день Церковь Святой Троицы в Вильно принадлежит униатской церкви. Богослужения в ней проходят на украинском и белорусском языках.